Genauere Erläuterungen zum Fingerprint

Der genetische Fingerabdruck wurde erstmals 1988 in den USA in einem Gerichtsverfahren zugelassen. Seitdem hat er in zunehmenden Maße bei Gerichtsverfahren auf der ganzen Welt an Bedeutung gewonnen. Mit den gewonnenen Erkenntnissen aus diesem Test lassen sich eindeutige Aussagen über Ab- bzw. Anwesenheit von Verdächtigen am Tatort machen. Bei Vergewaltigungen lassen sich die Täter sogar auf diesem Wege direkt mit der Tat in Verbindung bringen.

Doch nicht nur in der forensischen Arbeit hat der genetische Fingerabdruck, auch DNA-Fingerprinting genannt, seine Berechtigung, sondern generell immer dann, wenn vergleiche zwischen verschiedenen DNA-Proben schnell, kostengünstig und gleichzeitig mit einer zuverlässigen Sicherheit gebraucht werden (siehe Anhang Skript zum Praktikum: Andere Beispiele von Anwendungsmöglichkeiten des DNA Fingerprinting)

Das menschliche Genom besteht aus ca. 3,5 x 10⁹ Basenpaare (bp). Der größte Teil unserer DNA enthält jedoch keine Information (sog. junk-DNA). Bestimmte DNA-Bereiche, welche sich aus mehrfach wiederholenden, kurzen Sequenzen zusammensetzen (sog. „Tandem repeats“; z.B. ...CAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT...) nennt man auch Minisatelliten-DNA. 

Ein Austausch oder Wegfall eines Nukleotids oder eine Umlagerung ganzer Sequenzteile werden in diesen DNA-Bereichen toleriert, weil es nicht zu Fehlfunktionen innerhalb des Organismus kommt, da sie kein Proteinkorrelat aufweisen. Man kann davon ausgehen, dass solche Mutationen, die an die Nachkommen weitergegeben werden, etwa alle 100 bp auftreten. Man bezeichnet sie als Sequenzpolymorphismen.

Im Laufe der Evolution führte die Anhäufung solcher Mutationen zu großen Unterschieden in den Genomen von nicht näher verwandten Individuen einer Art. Der genetische DNA-Fingerabdruck nutzt die große Variabilität dieser Sequenzen, die auch die Schnittstellen für Restriktionsenzyme (weitere Erläuterungen weiter unten im Text) betrifft.

Schneidet man DNA verschiedener Individuen mit dem gleichen Restriktionsenzym, so weichen die erhaltenen DNA-Fragmente in ihrer Länge voneinander ab. 

Den hierbei beobachteten Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) macht man sich beim Fingerprinting zunutze. Da die Minisatelliten-DNAs in Anzahl und Vorkommen sehr variabel sind, ist die Wahrscheinlichkeit, dass zwei nicht miteinander verwandte Individuen das gleiche Bandenmuster aufweisen verschwindend gering (Größenordnung von 10^-11). Identische Bandenmuster sind nur bei eineiigen Zwillingen zu finden. (vgl. IBELGAUFTS, H. 1990, S.145)

Wenn man sich ein DNA-Molekül als linearen Faden vorstellt findet man zwischen den codierenden Teilen die DNA-Stücke mit den repetitiven Sequenzen (variable number of tandem repeats = VNTR).

Durch die unterschiedliche Länge dieser VNTR verändert sich auch der Abstand zwischen zwei Restriktionsschnittstellen (Pfeile). So entstehen bei einer Restriktion mit den geeigneten Enzymen unterschiedlich lange Fragmente (gestrichelte Linie). (vgl. IBELGAUFTS, H. 1990, S. 410)

Hier nun ein (stark vereinfacht dargestellt) das Prinzip des DNA-Fingerprinting:

Es wurde auf die Darstellung der VNTRs verzichtet.

Man erhält folgende Fragmentgrößen:

Tatort: B>D>C>A     Verdächtiger 1: B>A>C      Verdächtiger 2: B>D>C>A

d.      Trennt man nun die DNA-Proben in einem Gel elektrophoretisch auf wandern die Fragmente vom Tatort und von Verdächtigen Nr.2 gleich schnell und ergeben ein identisches Bandenmuster.

Man muss also die erhaltenen Fragmente in einer Gelelektrophorese auftrennen und sichtbar machen. Identisches DNA-Material (etwa von einem Tatort und einem Verdächtigen) ergeben dann ein identisches Bandenmuster in der Gelmatrix, da sie gleich große Fragmente von DNA enthalten.

(vgl. HAFNER, L. u.a. 1997, 213).

Zu den Restriktionsendonucleasen

1968 wurde in Bakterien (Dr. Werner Arber von der Universität Basel, Dr. Hamilton Smith von der J.Hopkins Universität in Baltimore und D. Nathans) eine Gruppe von Enzymen in Bakterien entdeckt, die DNA an ganz spezifischen Basenpaarungen aufbrechen können. Chemisch gesehen wird hierbei die Zucker-Phosphatkette der DNA hydrolysiert.

Diese molekularen „Scheren“ nennt man Restriktionsendonucleasen.

Ein solches Restriktionsenzym lagert sich an die DNA an und erst eine spezifische Basenerkennungssequenz (Restriktionsort) veranlaßt das Enzym die Bindungen zu spalten.

Bakterien verwenden solche Restriktionsendonucleasen um Phagen-DNA abzubauen, noch bevor sie sich repliziert und neue Phagenpartikel synthetisiert werden. Die bakterieneigene DNA ist von der Spaltung an den spezifischen Basenpaarungen durch zusätzliche Methylgruppen geschützt. Diese Methylgruppen blockieren die Restriktionsendonuclease. Die Entdeckung dieser Enzyme, für die die oben genannten Forscher 1978 den Nobelpreis erhielten, war eine der wichtigsten Voraussetzungen für die Gentechnik.

Heute kennt man über 1.200 dieser Enzyme. Man unterteilt sie in drei Klassen: Die Typen der Klassen I und III sind für die Gentechnik nur von sehr geringer Bedeutung. Ihre Wirkungsweise ist sehr kompliziert. Die Restriktionsendonucleasen der Klasse II sind die in der Gentechnik gebräuchlichen Schneideenzyme. Ihnen charakteristisch ist die bezeichnete Erkennungssequenz.

In der Tabelle 1.1. sind einige dieser Enzyme, der Organismus aus denen sie zuerst isoliert wurden und ihre Erkennungssequenz aufgelistet:

Tabelle 1.1: Erkennungssequenzen einiger Restriktionsendonucleasen

Enzym	Organismus	Erkennungssequenz*
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens	GGATCC
HindIII	Haemophilus influenzae Rd	AAGCTT
TaqI	Thermus aquaticus	TCGA
EcoRI	Escherichia coli	GAATTC
PvuI	Proteus vulgaris	CGATCG
Sau3A	Staphylococcus aureus	GATC

Eine andere Methode zum Vergleichen verschiedener Genome wäre die Analyse zufällig amplifizierter polymorpher DNA (random amplification of polymorphic DNA, RAPD). Diese Methode verlangt jedoch nach einem `Cycler`, einem Gerät mit dem man PCR[1]-Reaktionen durchführen kann, um Genbereiche zu amplifizieren.