2.2 Gelelektrophorese und Färben der DNA-Proben

Nun gilt es, eventuelle Veränderungen der DNA-Proben durch die Restriktion einer Analyse zugänglich zu machen. Da wir Veränderungen auf molekularer Ebene nachweisen wollen und diese für uns nicht unmittelbar sichtbar sind, muss die DNA nach der Elektrophorese gefärbt werden.

2.2.1 Materialien 

2.2.2 Durchführung 

1) Nach der Entnahme der Restriktionsansätze aus dem Kühlschrank werden zu jeder Probe mit einer neuen Pipettenspitze je 2µl des Blaumarker "LD" hinzupipettiert (dieser macht die Lauffront der DNA-Proben für uns sichtbar). Die Gefäße werden verschlossen und die Komponenten der Proben durch vorsichtiges anschnicken mit dem Finger gemischt.

2) Beim Praktikumsleiter wird ein bereits gegossenes Agarose-Gel im Gelschlitten abgeholt oder selbst gegossen.

Die Agarose wird in TBE-Puffer gelöst und erhitzt.                  Das auf ca. 37 °C abgekühlte Agarose-Gel wird gegossen.

3) Das Gel wird in dem Gelschlitten in der Elektrophoresekammer platziert. Beim Platzieren muss die Laufrichtung beachtet werden! Nun wird die Kammer mit dem TBE-Puffer gefüllt, bis das Gel bedeckt ist. Erst jetzt wird der Schlitzkamm vorsichtig aus dem Gel herausgezogen

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4) Nun wird das Gel nach folgendem Muster mit den Proben beschickt: Gele werden stets von links nach rechts "gelesen", wobei die Schlitze (Slots) immer oben sind. Es werden jedesmal mit einer neuen Pipettenspitze 15µl pro Probe in einen Slot gegeben. Slot 1: Lamda/HindIII DNA Längenmarker "M" Slot 2: Tatort DNA, grün Slot 3: V1, blau Slot 4: V2, orange Slot 5: V3, violett Slot 6: V4, rot

5) Nun wird die Kammer geschlossen. Die Stromquelle wird angeschlossen (Polung beachten!) und die Elektrophorese bei 100 V gestartet. Die Laufzeit beträgt 35-45 Minuten.

   

Das Gel wird bestückt und die Elektrophorese gestartet.

6) Nach Ende der Elektrophorese (Stromquelle ausschalten!) wird das Gel mit dem Schlitten aus der Kammer genommen. Vorsicht hierbei, das Gel ist sehr glitschig und rutscht leicht aus dem Schlitten! Schiebe das Gel mit den Fingern vom Schlitten direkt in das Färbeschälchen.

7) Zum Gel wird 60 ml der Bio-Safe DNA Färbelösung gegossen und übernacht darin belassen.

8) Am folgenden Tag wird die Färbelösung abgegossen und mehrfach mit entionisiertem Wasser gespült, um überschüssige Färbelösung zu entfernen.

9) Das Wasser wird gesammelt und vorschriftsmäßig entsorgt.

10) Das Gel wird für die Analyse fotografiert.

2.3 Analyse der DNA-Bandenmuster 

Durch die Färbelösung sind die DNA-Proben für uns sichtbar gemacht worden. Der Farbstoff besitzt eine sehr hohe Affinität für DNA-Moleküle und verbindet sich mit den DNA-Fragmenten. Es sollten sich folgende Bandenmuster ergeben: 

Um für die zukünftigen PraktikantInnen nicht die Spannung zu nehmen bilden wir hier nur ein Gel ab, ohne es zu kommentieren.

Häufige Fehlerquellen:

- falsches pipettieren (Menge, Reihenfolge)

- berühren von Pipettenspitzen mit den Händen 

- Pipettenspitze nicht gewechselt

- Polung falsch gewählt

- Restriktionsansatz nicht gut gemischt 

- Tropfen von Restriktionskomponenten verblieben an der Gefäßwand

- Enzyme sind inaktiv 

- Inkubationstemperatur zu hoch

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