1.2. Vorüberlegungen und Zusatzinformationen

Eine der von Wissenschaftlern gefundenen Ideen beinhaltete die Ermittlung der Basenabfolge (Sequenzierung) der DNA-Proben und der anschließende Vergleich miteinander auf Übereinstimmung. Dies wäre mit Sicherheit die zuverlässigste Methode. Mit den heutigen Methoden würde eine detaillierte Analyse der gesamten Basenfolge der DNA-Proben allerdings viel zu lange dauern (siehe Größe des menschl. Genoms weiter unten). Außerdem darf die eigentliche Erbinformation in der DNA aus datenschutzrechtlichen Gründen nicht ermittelt und gespeichert werden. Es bedarf daher einer einfacheren Methode.

•  Wie lassen sich denn überhaupt Unterschiede in der Basensequenz feststellen?

Um hierfür deinen Plan weiterentwickeln zu können, werden im folgenden einige Entwicklungen aus dem Bereich der rekombinanten DNA-Technologie erläutert.

1968 wurde in Bakterien [Dr. Werner Arber von der Universität Basel und Dr. Hamilton Smith von der J.Hopkins Universität in Baltimore] eine Gruppe von Enzymen entdeckt, die DNA an ganz spezifischen Basenpaarungen aufbrechen können. Chemisch gesehen wird hierbei die Zucker-Phosphatkette der DNA hydrolysiert. Diese molekularen "Scheren" nennt man Restriktionsendonucleasen. Ein solches Restriktionsenzym lagert sich an die DNA an und erst eine spezifische Basenerkennungssequenz (Restriktionsort) veranlasst das Enzym die Bindungen zu spalten.

Mit zwei Restriktionsendonucleasen wirst du in diesem Praktikum arbeiten:

Hier noch einmal der genaue Wirkort der Restriktionsendonucleasen BamHI und HindIII:

a) Wieviel DNA Stücke (Fragmente) entstehen bei dieser Restriktion? 

b) Die Größe von DNA Fragmenten wird mit der Zahl ihrer Basenpaare (bp) angegeben. Wie groß sind die Fragmente aus Frage a)? 

c) Wieviel Fragmente erhältst du, wenn folgendes DNA-Molekül mit BamHI und HindIII inkubierst? Gib auch die Fragmentgröße an.

AATAGCTAAGCTTTGCTTACCATCCTAGGAGGCTTAGCATCGAGCTTT

Im folgenden nun ein kurzer Informationstext, über das menschliche Genom.

Das menschliche Genom besteht aus ca. 3,5 x 109 bp. Der größte Teil unserer DNA enthält jedoch keine Information (sog. junk-DNA). Ein Austausch oder Wegfall eines Nukleotids oder eine Umlagerung ganzer Sequenzteile werden in diesen DNA-Bereichen toleriert, weil es nicht zu Fehlfunktionen innerhalb des Organismus kommt. Man kann davon ausgehen, dass solche Mutationen, die an die Nachkommen weitergegeben werden, etwa alle 100 bp auftreten. Man bezeichnet sie als Sequenzpolymorphismen (polymorphie (gr): viel-, verschiedengestaltig). Im Laufe der Evolution führte die Anhäufung solcher Mutationen zu erheblichen Unterschieden in den Genomen von nicht näher verwandten Individuen einer Art. Der genetische DNA-Fingerabdruck, auch DNA-Fingerprinting genannt, nutzt die große Variabilität dieser Sequenzen, die auch die Schnittstellen für Restriktionsenzyme betrifft. Schneidet man DNA verschiedener Individuen mit dem gleichen Restriktionsenzym, so weichen die erhaltenen DNA-Fragmente in ihrer Länge voneinander ab. Den hierbei beobachteten Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) macht man sich beim Fingerprinting zunutze. (vgl. HAFNER, L. u.a. 1997, 213).

Erkläre nun mit deinen eigenen Worten, wie das Verfahren mit den DNA-Proben bis hierhin aussieht. Welche Vorschläge hast du, um Unterschiede in der Fragmentgröße nachzuweisen?

Die Täter - DNA wird mit Restriktionsenzymen in ein Lösungsmittel gegeben. Unabhängig davon geschieht dasselbe auch mit den DNA-Strängen der vier Verdächtigen. Die jeweiligen Erkennungssequenzen veranlassen das Enzym die DNA - Doppelstränge an bestimmten Stellen aufzuschneiden, wodurch sog. " sticky ends " entstehen. Je häufiger die Erkennungssequenzen vorliegen, desto mehr DNA Fragmente entstehen. Je näher oder weiter die Erkennungssequenzen auf dem DNA - Molekül entfernt liegen, desto kleiner oder größer werden die Fragmente. Ist die Verdächtigen -DNA nun nicht die Täter - DNA, so müsste eine unterschiedliche Anzahl von Fragmenten und somit auch Fragmente unterschiedlicher Größe vorliegen. Um eventuelle Unterschiede in der Fragmentgröße nachzuweisen haben wir folgenden Vorschlag: Man könnte das Prinzip der Chromatographie anwenden, welches folgendermaßen funktioniert: Die Lösung wandert eine feinporige Trägerschicht ( Filterpapier ) entlang. Die Wechselwirkung DNA-Fragment und Trägermaterial ist unterschiedlich stark ausgeprägt, da die Moleküle der Lösung unterschiedlich groß sind. Je geringer die Bindungskräfte Molekülfragment - Trägermaterial, desto früher setzt sich Molekülfragment ab.

Da wir uns für Veränderungen auf molekularer Ebene interessieren, scheint es für uns unmöglich zu sein sichtbare und analysierbare Resultate zu erhalten.

Es ergeben sich daher weitere Fragen:

1. Wie können wir nun feststellen, ob sich in unseren DNA-Proben BamHI und HindIII Restriktionsorte befinden?

2. Wenn solche Restriktionsorte existieren, wie können wir feststellen, welche Fragmente (Größe und Anzahl) sich in jeder einzelnen DNA-Probe befinden ?

3. Welchen Lösungsvorschlag hast du?

An dieser Stelle beginnt nun der zweite Schritt des Verfahrens des DNA-Fingerprinting. Fülle die Lücken aus und beantworte die Fragen.

Wie Proteine und viele andere Biomoleküle trägt auch die DNA eine elektrische Ladung, und zwar eine _______. Deshalb wandert sie, wenn man sie in ein elektrisches Feld bringt, in Richtung des __________ Pols. Die Wandergeschwindigkeit eines Moleküls hängt von zwei Eigenschaften ab: von seiner Form und seiner elektrischen Ladung. Leider haben aber die meisten DNA-Moleküle die gleiche Form und im Verhältnis zu ihrer Masse annähernd die gleiche Ladung. Durch einfache Elektrophorese ("mit Elektrizität tragen") kann man deshalb Fragmente unterschiedlicher Größe nicht voneinander trennen. Die Größe der DNA-Moleküle wird aber zu einem wichtigen Faktor, wenn man die Elektrophorese in einem Gel ablaufen lässt. Ein solches Gel, das gewöhnlich aus Agarose besteht, enthält ein kompliziertes System von Poren. Durch diese Öffnungen müssen die DNA-Moleküle wandern, um die _________ Elektrode zu erreichen. Deshalb werden DNA-Moleküle in der Gelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt. Fragmente mit der gleichen Größe bewegen sich dabei mit der gleichen Geschwindigkeit durch das Gel (vgl. BROWN, T.A. 1995, 85).

Fragen zur Elektrophorese:

1. An welcher Stelle der DNA befinden sich die Ladungen?

2. Warum werden DNA-Moleküle bei der Gelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt?

3. Welche DNA-Fragmente (große oder kleine) werden wir nach Ende einer Gelelektrophorese näher bei der Kathode bzw. Anode finden und warum?

Hier noch einmal die herkömmliche Elektrophorese (a) und die Gelelektrophorese (b) in einem Querschnittschema. Beschrifte bitte die Elektroden.

Abb. aus: BROWN, T.A. 1995, 86

Folgende Abbildung fasst noch einmal vereinfacht zusammen:

Quelle: Focus-Magazin